Guillaume Depardieu est né le 7 avril 1971 dans le 14e arrondissement de Paris. Il est le fils des acteurs Gérard Depardieu et Élisabeth Depardieu qui a repris son nom de jeune fille, Guignot, après son divorce. Il est le frère aîné de l'actrice Julie Depardieu, née le 18 juin 1973 de son père Gérard et de sa mère Élisabeth. Il est le demi-frère de Roxanne Depardieu née le 28 janvier 1992 de son père Gérard et du mannequin Karine Sylla. Il est le demi-frère de Jean Depardieu né le 14 juillet 2006 de son père Gérard et de la comédienne Hélène Bizot, fille de l'ethnologue François Bizot.

Enfant, son père l'emmène avec lui quelquefois sur des plateaux de tournage et le fait figurer dans quelques-uns de ses films : Pas si méchant que ça de Claude Goretta en 1974, Jean de Florette de Claude Berri en 1986 et Cyrano de Bergerac de Jean-Paul Rappeneau en 1990.

En 1988, âgé de 17 ans, Guillaume est condamné à la prison dans le quartier des mineurs. Puis condamné à trois ans d'emprisonnement (dont il ne fait que la moitié) à Bois-d'Arcy pour toxicomanie, usage, importation et trafic d'héroïne. Il est condamné par la suite à plusieurs reprises pour outrages, rébellions et pour diverses infractions routières.

En 1991, âgé de 20 ans, il joue son premier grand rôle dans le film biographique Tous les matins du monde d'Alain Corneau où il incarne le joueur de viole de gambe Marin Marais jeune, alors que son père joue le rôle du même personnage plus âgé. Il se reconstruit et enchaîne une trentaine de films avec un certain succès.

En 1995, une valise tombée d'un véhicule sous le tunnel de Saint-Cloud le fait chuter de moto. Il est hospitalisé à l'Hôpital Raymond-Poincaré de Garches pour une grave blessure au genou. L'opération tourne mal. Il contracte deux staphylocoques dorés dans l'os du genou à l'hôpital : à cette période, il continue d'abuser des drogues par injection multipliant les risques d'infections au sein même de l'hôpital. Il subit 17 interventions, de nombreux traitements et un an d'hospitalisation qui ne font qu'empirer douloureusement et dramatiquement sa blessure.

En 1995, il est à l'affiche du film Les Apprentis de Pierre Salvadori, pour lequel il obtient le César du meilleur espoir masculin en 1996.

Le 30 décembre 1999, âgé de vingt-huit ans, après avoir partagé un temps la vie de l'actrice Clotilde Courau, il épouse la comédienne Élise Ventre avec laquelle il a une fille, Louise, le 16 janvier 2001.

En 2001, Guillaume incarne un fils rejeté qui kidnappe son père, écrivain célèbre, dans Aime ton père de Jacob Berger.

En 2003, âgé de trente-deux ans, après huit ans de souffrance intolérable que les antibiotiques et la morphine ne soulagent plus, il décide de se faire amputer la jambe droite pour ne plus souffrir et de se faire poser une prothèse performante pour pouvoir marcher de nouveau.

Durant son hospitalisation, il est influencé par sa sœur Julie passionnée de musique classique. Il écrit un opéra. Il écrit également des dizaines de chansons comme « À force de » pour Barbara.

Guillaume fonde avec succès la Fondation Guillaume-Depardieu à Bougival dans les Yvelines, où il vit près de sa mère, pour regrouper les témoignages et représenter les 800 000 cas annuels dont 10 000 cas fatals d'infection nosocomiale. Il attaque l'État et l'Hôpital Raymond-Poincaré de Garches pour « acharnement thérapeutique » et victime d'infection nosocomiale, devant la justice française, puis devant la Cour européenne pour obtenir reconnaissance, réparation et trouver des solutions.

Guillaume Depardieu est condamné le 17 septembre 2003 par le tribunal correctionnel de Lisieux dans le Calvados à neuf mois de prison avec sursis, 18 mois de mise à l'épreuve avec obligation de soins, 5 000 € d'amende et 3 000 € de dommages-intérêts au plaignant pour avoir tiré un coup de feu après une altercation avec un admirateur le 22 août dans une rue de Trouville-sur-Mer.

En 2004, il fait éditer un livre-entretien Tout donner co-écrit avec Marc-Olivier Fogiel.

En 2006, après son divorce, il était à l'affiche du film Célibataires de Jean-Michel Verner, comédie romantique dans l'air du temps aux côtés de l'actrice Olivia Bonamy.

Il décède le lundi 13 octobre 2008 d'une pneumonie foudroyante à l'hôpital Raymond-Poincaré de Garches à l'âge de 37 ans. Alors qu'il tournait en Roumanie depuis plusieurs semaines L'Enfance d'Icare d'Alex Iordachescu, avec Alysson Paradis, l'acteur a contracté une pneumonie qui l'a forcé à être rapatrié à l'hôpital de Garches, où il décède trois jours après avoir contracté la maladie.